去势大鼠血清血管内皮生长因子水平和骨密度的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.003

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (28): 5113-5119.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.003

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去势大鼠血清血管内皮生长因子水平和骨密度的相关性

鲍小明，王云，侯永新，李军，张民，卫小春

山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001

出版日期:2013-07-09 发布日期:2013-07-09
通讯作者: 张民，博士，副主任医师，山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030001 zhangminty@yahoo.com.cn
作者简介:鲍小明，男，1984年生，陕西省延安市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事骨与关节损伤方面的研究。 sxmu2010@126.com
基金资助:
山西省科技攻关项目(20100311098-2)

Correlation between bone mineral density and serum vascular endothelial growth factor levels in ovariectomized rats

Bao Xiao-ming, Wang Yun, Hou Yong-xin, Li Jun, Zhang Min, Wei Xiao-chun

Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Online:2013-07-09 Published:2013-07-09
Contact: Zhang Min, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China zhangminty@yahoo.com.cn
About author:Bao Xiao-ming, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China sxmu2010@126.com
Supported by:
Scientific and Technological Projects of Shanxi Province, No. 20100311098-2*

摘要/Abstract

摘要：

背景：血管内皮生长因子在促进骨质疏松性骨折愈合中发挥重要作用，而它是否影响骨密度变化还没明确。
目的：观察去势大鼠血清血管内皮生长因子水平和骨密度及成骨细胞变化的相关性。
方法：SD雌性大鼠40只随机数字表法均分为去势组和对照组，3个月后测大鼠全身、腰椎及股骨骨密度。大鼠ELISA试剂盒测血清中血管内皮生长因子的水平，同时两组大鼠股骨干骺端固定，脱钙，脱水、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色，每切张片随意取5个视野(10×40)行股骨远侧干骺端成骨细胞计数在光学显微镜。
结果与结论：去势3个月后大鼠体质量明显增加(P < 0.05)，去势组全身、腰椎及股骨骨密度较对照组全身、腰椎及股骨骨密度降低(P < 0.05)，表明骨质疏松的模型建立。而去势大鼠和对照大鼠血管内皮生长因子水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)，去势组及对照组的成骨细胞数量无明显差异(P > 0.05)，去势组及对照组骨密度与成骨细胞数及血清血管内皮生子水平无相关性。提示去势大鼠的骨密度下降，体质量升高，而去势大鼠骨密度的降低与血清血管内皮生长因子变化可能无关。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 去势大鼠, 骨质疏松, 血管内皮生长因子, 成骨细胞, 骨密度, 股骨干骺端, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor play an important role in promoting healing of osteoporotic fractures, but whether it can affect the bone mineral density is not clear.

OBJECTIVE: To observe the correlation between serum vascular endothelial growth factor, bone mineral density and the number of osteoblasts in the ovariectomized rats.

METHODS: Forty female Sprague-Dawley rats were randomly divided into ovariectomized group and control group. After 3 months, the bone mineral density of the whole body, femur and lumbar spine was measured. Rat enzyme-linked immunosorbent assay kit was used to measure the level of serum vascular endothelial growth factor. Then, the rats in two groups received femoral metaphyseal fixation, decalcified, dehydrated, embeding in paraffin, slicing and hematoxylin-eosin staining. Each slice was free to take five fields of view (10×40) in order to count the osteoblasts of femur distal metaphysis under optical microscope.

RESULTS AND CONCLUSION: After ovariectomized for 3 months, the rats body mass was increased significantly (P < 0.05), and the bone mineral density of the whole body, femur and lumbar spine in the ovariectomized group was lower than that in the control group (P < 0.05), indicating the successful establishment of osteoporosis model. There was no significant difference in vascular endothelial growth factor level between the ovariectomized group and the control group (P > 0.05), and the difference of the osteoblast number between ovariectomized group and control group was not significant (P > 0.05). This indicated that there was no correlation between bone mineral density and the number of osteoblasts and vascular endothelial growth factor level in the ovariectomized group and the control group. These findings suggest that the bone mineral density is reduced and the body mass is increased in the ovariectomized rats, and the reduced bone mineral density of ovariectomized rats may be irrelevant with the change of serum vascular endothelial growth factor.

Key words: tissue construction, bone tissue construction, ovariectomized rat, osteoporosis, vascular endothelial growth factor, osteoblasts, bone mineral density, femoral metaphysic, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

鲍小明，王云，侯永新，李军，张民，卫小春. 去势大鼠血清血管内皮生长因子水平和骨密度的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(28): 5113-5119.

Bao Xiao-ming, Wang Yun, Hou Yong-xin, Li Jun, Zhang Min, Wei Xiao-chun. Correlation between bone mineral density and serum vascular endothelial growth factor levels in ovariectomized rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(28): 5113-5119.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2011年12月至2012年6月在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。
材料：
实验动物：选用健康6月龄未生育雌性SD大鼠40只，体质量(286.1±11.6) g，购自山西医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK(晋)2009-0001。实验过程动物处理符合善待实验动物伦理学基本要求。实验动物均由山西医科大学附属第二医院骨科实验室在24-28 ℃，通风良好，湿度60%-80%的相同条件下分笼饲养3个月。自由摄水摄食，颗粒饲料由山西医科大学实验动物中心提供。

实验方法：

骨质疏松模型建立：40只SD大鼠随机数字表法均分为2组：对照组和去势组。对照组不作任何处理，去势组大鼠在无菌条件下，大鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后术野剪毛，体积分数75%乙醇消毒，碘伏消毒，铺洞巾，经腹背部肋缘下1 cm，脊柱两侧各1 cm交界处，分别切两个1 cm左右切口，切开两侧皮肤、皮下及肌肉，进入腹腔，剪开腹膜，找到卵巢并结扎并切除双侧卵巢，并使用丝线将残端结扎依次的关闭各层伤口。术后经腹腔注入40×10⁴ U青霉素预防感染。

骨密度测定：应用QDR-4500A型扇形束DXA (Hologic公司，美国)及附的小动物软件测量大鼠全身、股骨及腰椎的骨密度。测量骨密度前测量大鼠的体质量和身长，大鼠利用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后，将大鼠放到测量台上，分别测量大鼠的股骨和腰椎、全身的骨密度，并记录骨密度数据。

血清血管内皮生长因子测定：利用大鼠心脏取血样品4.0-5.0 mL，不抗凝，待血凝后，以3 000 r/min，离心半径5 cm，离心10 min，分离血清，置-70 ℃冰箱内保存待测。血清血管内皮生长因子水平的测定采用酶连接免疫吸附测定法-ELISA检测。第一抗体用特异的兔抗血管内皮生长因子多克隆抗体，其与小鼠、大鼠和人血管内皮生长因子均有免疫反应。先将酶标板孔依次编号，每孔加入100 μL 的样品分析液，然后加入100 μL 的标准品或样品，混匀加盖封口，室温下孵育2 h后弃液。用冲洗液冲洗3 次，400 μL/次，各孔加入200 μL的辣根过氧化物酶标记的第二抗体，混匀封口，室温下静置2 h后弃液，再用冲洗液冲洗3次，在各孔中加入底物显色液200 μL/孔，混匀，室温下静置25 min后，各孔加入50 μL的反应终止液，混匀。在30 min内用DENLEYDRAGON型酶联(标) 仪在波长450 nm的条件下，测定各孔的吸光度值(A)。根据所测出的样品孔及平行孔的A值，求出A的均数。依此均数在绘好的标准曲线上，求出各孔中的血管内皮生长因子含量，然后再换算出各样品中的血管内皮生长因子质量浓度(ng/L)。

成骨细胞观察计数：3个月后将去势组及对照组大鼠脱臼处死，取出大鼠股骨剃净肌肉等组织，将股骨远侧干骺端放置40 g/L中性多聚甲醛固液4 ℃固定两三天，将甲醛固定后骨组织置入脱钙液(甲醛-盐酸脱钙液：盐酸5 mL、甲醛10 mL、蒸馏水85 mL) 脱钙20 h，脱钙完全至骨组织软化，自来水(流水) 冲洗过滤，而后将骨块常规脱水，石蜡包埋、制备成5 µm切片，最后行苏木精-伊红染色、常规脱水、透明封固，切片制成。每个骨块标本做2张切片，每张片随意取6个视野(10×40)，利用光学显微镜进行股骨远侧干骺端松质骨区成骨细胞计数。

主要观察指标：大鼠骨密度及成骨细胞数量及血管内皮生长因子的变化。

统计学分析：实验所得数据建立EXECL数据库，实验使用SPSS 19.0统计分析软件(SPSS 美国)，实验所得数据均用x(_)±s表示，去势组与对照组骨密度、成骨细胞数量、血管内皮生长因子浓度、体质量使用t 检验。血管内皮生长因子水平和全身、腰椎、股骨骨密度及成骨细胞数量的相关性分析使用双变量相关分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

Pomnler于1885年率先提出骨质疏松症的概念，其意为骨质减少的一种疾病。1948年Albright认为这种病是由于雌激素减少，导致骨小梁形成减少、蛋白质代谢异常的一种疾病^[11] 。现在学者们对骨质疏松的发病机制还没有明明确，如果能表明骨质疏松症的发病原因则就有有效的治疗的方法，实验探讨血管内皮生长因子在骨质疏松骨密度的发病机制中可能的机制。现在去卵巢大鼠造成骨质疏松模型的最常用的动物模型之一^[12-13]，去卵巢大鼠的雌激素降低，导致骨量的降低，而大鼠的骨质疏松的主要的特征是骨量的显著下降，骨量下降的水平现在通过骨密度测量来评价，主要是利用双能X射线测量大鼠的骨密度，实验测量全身、腰椎及股骨的骨密度在去卵巢3个月后，去势组与对照组存在明显差异 (P < 0.05)，同时去势组大鼠体质量增加(P < 0.05)，表明骨质疏松的模型建立成功。
实验结果表明去势大鼠中血管内皮生长因子水平比对照组的低，但是差异无显著性意义(P > 0.05)，在对照组中血清血管内皮生长因子与全身、腰椎及股骨的骨密度的变化无显著的相关性，去势组中血清血管内皮生长因子水平与全身、腰椎及股骨的骨密度无显著的相关性。同样去势组及对照组的血清血管内皮生长因子水平与成骨细胞变化无明显的相关性。
探究血管内皮生长因子在骨质疏松症病理生理学的中的作用，实验需要研究血管内皮生长因子在骨组织中的影响。有许多研究探讨骨组织的血管内皮生长因子的作用^[7，9] ，血管内皮生长因子是一种促血管生长因子及在血管内皮细胞具有较高的特异性^[7，12] 。血管内皮生长因子可以由不同类型细胞释放，可导致毛细血管通透性和血管内皮细胞增殖增加，而血管内皮生长因子参与骨代谢由成骨细胞系的细胞分泌，作用于不同靶细胞发挥不同的作用，一方面，参与骨的血管形成的过程，通过新生血管的数量增多，提供了各型细胞聚集所需管道系统，参与到骨丢失的机制中；另一方面，作为破骨细胞的诱导物，促使破骨细胞的分化，参与激活骨吸收活动，从而最终引起骨质疏松的发生。而骨质疏松中其骨组织中存在血流下降和窦状微血管缺损，血管内皮生长因子通过促进内皮细胞增殖，提高血管通透性，改变细胞外基质等生物学作用，促进骨质疏松骨组织内血管形成，从而在骨质疏松骨重建中发挥重要的作用。
血管内皮生长因子也在生长板有肥大软骨细胞分分泌，发挥重要作用在刺激骨形成和软骨吸收所需要的血管结构的生长^[14-15] ，Ferrara等^[9]发现血管内皮生长因子在血管生成以及成骨细胞增殖和迁移中发挥重要作用。同时血管内皮生长因子可调节成骨细胞及破骨细胞活性^[16] ，另外血管可以作为运输循环成骨细胞的作用到有活性的骨重建部位^[17] 。Zelzer等^[18]研究表明在骨形成血管内皮生长因子具有3个主要的功能：诱导血管生成(膜内的、软骨内的)，破骨细胞趋化迁移至肥厚软骨及激活成骨细胞。此外Keramaris等^[19]发现血管内皮生长因子直接影响骨原细胞是依靠通过促进成骨细胞分化和增加的再生骨的矿化。
有许多因素参与骨形成，在这些因子中血管内皮生长因子能够促进新血管形成特性及促进骨折愈合。Street等^[6]表明抑制血管内皮生长因子可抑制软骨骨化和膜内的骨化的小鼠骨愈合，在老鼠与股骨骨折，血管内皮生长因子受体数量下降可导致减少血管生成、骨形成、愈伤组织矿化。血管内皮生长因子抑制也降低胫骨皮质骨缺损愈合，这些研究证明血管内皮生长因子在成骨细胞分化方面发挥直接自分泌作用^[6] 。而实验研究表明成骨细胞表达血管内皮生长因子减少可致成骨作用的减少及脂肪的增加^[20] 。
血管内皮生长因子对骨代谢影响有不同的研究，很少有研究骨质疏松和血管内皮生长因子之间关系。而有研究在骨质疏松症者血管内皮生长因子水平较低^[21] 。Costa等^[22]研究绝经后女性血管内皮生长因子和骨密度进行分析，研究者选252名平均年龄是64.5绝经后妇女，入选者血清血管内皮生长因子与血管内皮生长因子的单核苷酸G的多态性和钙的摄入有关，而同循环血管内皮生长因子和任何位点(腰椎、股骨颈、全髋)的骨密度都不相关，循环血管内皮生长因子可能受基因、环境、内分泌的影响。Chung等^[23]研究表明在绝经后女性血管内皮生长因子基因的多态性与骨质疏松椎体压缩骨折相关，但相关的研究都是样本较小，要求进一步大的样本的继续的研究但血管内皮生长因子基因的多态性和脊柱的骨密度相关的。
成骨细胞是骨形成及骨重建及修复中的主要功能细胞，负责骨基质的合成分泌和矿化。血管内皮生长因子在骨重建中的主要作用是：血管内皮生长因子可通过作用成骨细胞强表达的血管内皮生长因子1(fit-1)受体增加成骨细胞移动和分化功能，这对骨形成及修复起到正性调节作用。
Otomo等^[24]在6，9，16周的动态组织形态计量学分析证实了矿化表面、矿化沉积率和骨形成率在胫骨近端小梁骨下降显著、成骨细胞数及血清骨钙素显着降低、小鼠骨髓间充质干细胞矿化显著下降在血管内皮生长因子受体1(TK-/-)小鼠相对于血管内皮生长因子受体1(TK+/+)小鼠，这些研究结果表明，血管内皮生长因子受体1(TK-/-)小鼠表现出较低的小梁骨体积，血管内皮生长因子信号转导通路通过激活酪氨酸激酶可能参与到成骨细胞的分化及增殖。曾敬等^[25]用Y染色体追踪去势大鼠骨折处成骨细胞移植后血管内皮生长因子和血管内皮生长因子 mRNA的表达，发现血管内皮生长因子的动态表达对促进老年骨质疏松性骨折的愈合具有重要意义，可能是通过促进血管内皮生长因子的转录和表达，在骨折部位建立良好的血液循环，加速了骨形成。而刘志奎等[26]的研究显示，去卵巢组中表达血管内皮生长因子的成骨细胞数目比正常的少，骨质疏松大鼠骨折愈合形成的骨痂的质量较差，血管内皮生长因子在成骨细胞中表达的减少是骨质疏松性骨折愈合降低的原因之一。Martinez等^[27]通过人类成骨细胞培养研究血管内皮生长因子与年龄增长相关的变化，发现老年人的成骨细胞分泌血管内皮生长因子量减少，与老年性骨量(尤其是松质骨)减少相关。
血管内皮生长因子作为最有力的血管生成因子，可作用与基础多细胞单位中血管，通过和血管内皮细胞的特异性受体结合，促进内皮细胞增殖、提高血管通透性、改变细胞外基质以及增进单核细胞趋化性的方式促进血管的再生等生物学作用，促进骨组织内血管形成参与骨重建。Ding等^[28]的研究表明在去势大鼠胫骨中微血管的数量显著的减少较对照组，同时血管内皮生长因子的表达同时也减少，提示可能去势后血管增殖的能力降低，而还有研究证实体外中和血管内皮生长因子受体则血管产生减少^[6] 。而初同伟等^[29]将大耳白兔随机分对照组、血管内皮生长因子组及抗血管内皮生长因子组，各组于伤后8，24，72 h、1，3，5，8周利用单光子放射计算机断层显像术测定骨折端血流量变化，结果表明应用血管内皮生长因子使骨折端血流量在一定时间内较对照组增高，抗血管内皮生长因子可导致骨折端血流量明显减少，而杨钦泰等^[30]的研究局部应用Ph血管内皮生长因子可以改善肢体严重创伤后局部的血流，预防局部骨质疏松的发生。
在骨质疏松症的生理病理学中血管内皮生长因子活性增强与骨质疏松^[31-32] 。雌激素不足导致骨质流失是由于刺激破骨的形成。在大鼠巨噬细胞集落刺激因子是破骨前兆增殖和分化必需的[33]。血管内皮生长因子对破骨细胞骨吸收具有重要的调节作用。研究发现在老鼠体内血管内皮生长因子可导致正常巨噬细胞集落刺激因子生产、雌激素缺乏导致破骨细胞骨吸收的调节。而Niida等^[32]表明在骨质疏松老鼠中血管内皮生长因子是成熟破骨细胞生存的和功能所必需的。而血管内皮生长因子调节破骨细胞机制不明，可能涉及到其在骨发育和重建中，血管内皮生长因子能取代集落刺激因子11促进破骨细胞的生成：集落刺激因子1和核因子KB受体活化因子配体(RANKL)都是破骨系谱系细胞分化和破骨功能维持所必需的细胞因子。集落刺激因子11主要是促进破骨细胞前身细胞的募集和分化，对成熟破骨细胞并无明显的影响。国内学者曹敬等[34]用Y染色体追踪移植细胞在骨折愈合不同时相的存活、转归，及血管内皮生长因子、转化生长因子β1的动态表达，实验结果证明成骨细胞移植后可在受体骨折部位局部生存、生长繁殖，促进骨质疏松性骨折愈合，而移植的成骨细胞参与骨质疏松性骨折修复，血管内皮生长因子、转化生长因子β1的动态表达对促进骨折愈合起一定作用。
Motokawa等^[35]发现核因子KB受体活化因子配体是诱导破骨细胞的必要的，与缺乏核因子KB受体活化因子配体的对照组相比，血管内皮生长因子伴有的核因子KB受体活化因子配体诱导破骨细胞的数量有显著差异，血管内皮生长因子伴有核因子KB受体活化因子配体诱导的破骨细胞形成骨吸收陷窝比单独由核因子KB受体活化因子配体诱导的破骨细胞形成的差异大，提示血管内皮生长因子在成骨细胞的分化中发挥重要的作用。Niida等^[32]研究在集落刺激因子11缺乏的骨质硬化鼠模型(op/op鼠)中注射重组血管内皮生长因子后，结果表明血管内皮生长因子能诱导破骨细胞的募集，并能够促进破骨细胞分化，维持骨髓功能，可能有和集落刺激因子11相似的作用，提示集落刺激因子11和血管内皮生长因子在支持破骨细胞骨吸收有着相似的功能，研究者又把血管内皮生长因子受体1信号系统缺失引入骨质硬化鼠模型中，发现有更加严重的破骨细胞减少同时伴有成骨细胞数量下降^[36-37] 。
Aldridge等^[38]研究证实血管内皮生长因子是通过刺激血管内皮生长因子受体1介导对破骨细胞分化的，而对破骨细胞基质吸收能力是由血管内皮生长因子受体2介导的，从而提示血管内皮生长因子受体1是涉及到破骨细胞的分化，血管内皮生长因子受体2则涉及到破骨细胞的功能。而Nakagawa等^[39]研究表明在体外成熟的破骨细胞培养中可以观察到血管内皮生长因子结合到血管内皮生长因子受体1和血管内皮生长因子受体2，而血管内皮生长因子与其中一种或两种受体结合后发生酪氨酸磷酸化，可以直接提高破骨细胞的骨吸收活性和
细胞生存，且这种作用具有呈时间-剂量依赖性。KaKu等^[40]的实验表明在牙周围牙龈沟局部注射人重组血管内皮生长因子，发现注射组比非注射组牙周破骨细胞数量显著增加，且破骨细胞数量和局部注射的重组血管内皮生长因子的剂量成正比关系。而后续的研究中加入抗-血管内皮生长因子后，在每天注射抗-血管内皮生长因子组中破骨细胞的数量较对照组显著的下降，进一步表明了血管内皮生长因子在破骨细胞骨吸收中发挥重要的作用^[41] 。
而作者的实验证实去势大鼠的骨密度较对照组下降，而体质量较对照升高，去势组血清血管内皮生长因子水平及成骨细胞数无明显差异，去势组和对照组的骨密度与血清血管内皮生长因子变化没有相关性。

去势大鼠血清血管内皮生长因子水平和骨密度的相关性

Correlation between bone mineral density and serum vascular endothelial growth factor levels in ovariectomized rats

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